超高感度横方向

May 02, 2023

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ラテラルフローアッセイ (LFA) は迅速かつ安価ですが、感度は実験室ベースの検査の 1,000 倍近く低いです。 今回我々は、プラズモン活性抗体結合蛍光金ナノロッドが従来のLFAを超高感度にできることを示す。 サンプルから応答までの時間が 20 分以内で、標準的なベンチトップ蛍光スキャナーを介して読み取られたプラズモン増強 LFA は、4 時間にわたるゴールドスタンダードの酵素結合免疫吸着アッセイと比較して、ダイナミック レンジと検出限界において約 30 倍の改善を達成しました。また、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) 患者の血漿中の抗体および鼻咽頭ぬぐい液中の抗原に対して 95% の臨床感度と 100% の特異性を達成しました。 ヒト血清サンプル中のインターロイキン-6と鼻咽頭サンプル中のSARS-CoV-2のヌクレオカプシドタンパク質の検出で示したように、アッセイの性能における同等の向上は、安価なポータブルスキャナーによっても達成できます。 プラズモン増強された LFA は、感度、速度、ダイナミック レンジ、使いやすさ、コストの点で標準的な臨床検査よりも優れており、ポイントオブケア診断に利点をもたらす可能性があります。

ラテラルフローアッセイ（LFA）は、最もシンプル、最速、安価なポイントオブケア（POC）診断法の 1 つであり、疾患に対する集団レベルのスクリーニングに幅広い可能性をもたらします 1,2。 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) 抗体 3、4、5 および抗原 6、7 用の多数の LFA が導入されていますが、逆転写を伴うリアルタイム PCR などの検査室ベースの診断に匹敵する感度と定量性を備えたものはありません。 (RT–PCR) および酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA)8、9、10。 一般に、従来の比色 LFA は、これらの標準的な臨床検査よりも感度が約 1,000 倍低く 11,12、LFA を使用した診断では、陰性結果を正確に確立するために追加の臨床検査ベースの確認検査が必要です。 比色 LFA は、標的分析物の濃度変化に対する色の変化が限られているため、定量的な読み取りには不適切であることがよくあります 13。

2019 年コロナウイルス病 (COVID-19) のパンデミックは、正確かつ迅速な臨床診断、集団スクリーニング、疫学研究のための改良された LFA の必要性を浮き彫りにしました 14,15。 RT-PCR 16,17 および直接抗原検査 18,19 は、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の診断の主流であり、血清学的アッセイは感染段階とワクチンの有効性の決定、および疫学研究に重要です 3,20,21。 これらの診断アッセイは資格のある微生物研究所でのみ利用可能であり、依然として専門家に依存しており、多くの労力と時間を要します。 これらの制限により、疫学急増時に必要となる 1 日あたり数百万件の検査が不可能になっています 22,23。 したがって、研究室ベースのアッセイと同じくらい正確であるだけでなく、迅速で使いやすく、安価で、すぐに入手でき（家庭ベースおよびPOCでの使用に）、急速な人口増加に対応できる拡張性を備えた診断およびスクリーニングツールが非常に必要とされています。 -レベルのスクリーニング。

LFA の生物分析性能を向上させる取り組みには、レポーター要素として蛍光分子または量子ドットの使用が含まれています 24、25。 蛍光レポーターは定量化を向上させますが、信号強度が比較的弱いため感度と POC 診断の有用性が制限され、従来の金コロイドナノ粒子 (AuNP) と比較して光吸収が低い 26 ため、従来の LFA で可能であった直接視​​覚的検出が不可能になります。 さらに、高感度の検出器または強力な励起光源を備えた LFA リーダーの使用が必要です。 これらの考慮事項により、集団スクリーニングやリソースが限られた環境における蛍光 LFA の有用性が制限されます 10。

私たちは、最初のスクリーニングを視覚テストで実行し、必要に応じて蛍光リーダーを使用して同じ LFA ストリップ上でその後の定量テストを実行できる「バイモーダル」LFA を想定しています。 これを達成するために、我々は最近導入した27、プラズモニックフルオールと呼ばれる超高輝度蛍光ナノスケール構築物を、LFAの二峰性比色分析および蛍光レポーターとして使用しました（図1a）。 これらのナノスケール構築物は、プラズモン増強蛍光 28,29,30,31,32 を利用して、従来の分子蛍光団と比較してほぼ 7,000 倍明るい蛍光シグナルを達成します。 私たちはプラズモニック蛍光を検出抗体と結合させ、ヒトインターロイキン-6 (IL-6) (検出限界 (LOD)、93 fg ml-1)、SARS-CoV を使用して分析物の迅速かつ超高感度の比色検出および蛍光検出を可能にするために使用しました。 -2 S1 (スパイクタンパク質のサブユニット) 抗体 (LOD、185 pg ml-1) および SARS-CoV-2 抗原 (ヌクレオカプシド (N)) タンパク質 (LOD、212 pg ml-1)。 私たちは、SARS-CoV-2 S1 抗体、IL-6、および SARS-CoV-の検出のために血漿、血清、および鼻咽頭 (NP) のスワブサンプルをテストすることにより、プラズモニック蛍光ベースの LFA (p-LFA) の臨床有効性を検証しました。それぞれ 2 抗原に対応し、高い臨床特異性と感度を達成しました。 また、プラズモニック蛍光と互換性のあるポータブルな自己設計スキャナを使用して、p-LFA の定量的能力を実証し、その多用途な POC アプリケーションを実証します。 実質的に、この技術は、臨床的に関連する病原性感染症を診断するための研究室ベースの検査の代替として容易に導入できます。

a、LFAの二峰性ナノラベル（比色+蛍光）として使用されるプラズモニック蛍光の概略図。プラズモニックコアとしてAuNR、スペーサーとしてポリマー層、分子蛍光団（800 CW）および認識要素としてビオチンを含む。 b、c、AuNP（b）およびプラズモン蛍光（c）の透過型電子顕微鏡画像。 d、さまざまな濃度のAuNPを使用してドロップキャストされたニトロセルロース膜から得られた平均灰色値。 挿入図: ニトロセルロース膜の 8 ビット ImageJ 処理画像。 e、f、異なる濃度のプラズモン蛍光体（e）および分子蛍光体（f）を使用してドロップキャストされたニトロセルロース膜から得られた蛍光強度。 挿入図: ニトロセルロース膜の対応する蛍光画像。 g、異なる濃度のストレプトアビジン結合AuNPに曝露した後、試験部位でビオチン化BSAを捕捉リガンドとして使用し、ニトロセルロース膜から得られた平均灰色値。 挿入図:ストレプトアビジン結合AuNPの概略図。 h、異なる濃度のストレプトアビジン結合プラズモニック蛍光に曝露した後、試験部位の認識要素としてビオチン化BSAを用いてニトロセルロース膜から得られた蛍光強度。 挿入図:ストレプトアビジン共役プラズモニック蛍光の概略図。 紫色の矢印は、ナノ複合体の流れの方向を示します。 データは平均値±標準偏差です。 n = 4 回の反復テスト。 回路図は BioRender.com で作成されました。

LFA で従来の比色標識として使用されている 30 ～ 40 nm AuNP の 3 つの基本的な制限を克服するために、プラズモニック蛍光が最初に適用されました。 AuNP は捕捉率が低く (<5%)、シグナル対バックグラウンド比が低いため、感度が比較的低くなります 33,34。 最近 LFA 感度を向上させることが示された 100 nm AuNP を使用した場合でも、これらの問題は依然として残ります。 これら 3 つの制限のため、AuNP ベースの LFA の色の変化は、定性分析またはターゲット分析物の有無を示す単純なバイナリ出力に限定されます。

プラズモン蛍光 (長さ 98 ± 8.7 nm、直径 29.2 ± 3.1 nm) がこれらの制限を克服できるかどうかを評価するために、ニトロセルロース膜上の AuNP (直径 104 ± 13.4 nm) とその性能を比較しました。 プラズモン蛍光体 (および金ナノロッド (AuNR) コア) の局在表面プラズモン共鳴波長は、アスペクト比 36,37 を変更することで分子蛍光体 27 の励起波長と発光波長に一致するように調整され、ナノ構造の最適な寸法は次のように選択されました。私たちの以前の研究に基づいて、蛍光増強を最大化します38。 我々は、検出可能な可視シグナルまたは蛍光シグナルを生成するために必要なAuNPとプラズモニック蛍光の最小数を決定することに着手しました。 段階希釈した既知濃度の AuNP (図 1b および補足図 1) とプラズモニック蛍光 (図 1c および補足図 1) をニトロセルロース膜上にドロップキャストした場合、生成するには約 106 個の AuNP とプラズモニック蛍光の蓄積が必要でした。識別可能な可視信号（図1dおよび補足図2）。 ただし、検出可能な蛍光シグナルを生成するには、〜102個のプラズモニック蛍光のみが必要でした（図1eおよび補足図3）。 さらに、検出可能な蛍光シグナルを生成するには、約0.6×106分子の蛍光体（800 CW、プラズモニック蛍光の蛍光単位）の蓄積が必要でした（図1f）。これは、プラズモニック蛍光シグナルの検出可能な蛍光シグナルの濃度閾値が約6,000倍低いことを示しています。分子蛍光団と比較した蛍光。

プラズモニック蛍光は、AuNPの比色信号とほぼ同じ比色信号を示しました（補足図4）。 比色シグナルにより定性的な視覚検出 (肉眼による) が可能になり、比較的高濃度の標的分析物の場合に専用の読み取り装置の必要性がなくなり、一方、蛍光シグナルにより低濃度分析物の超高感度検出と定量が可能になりました。 したがって、プラズモン蛍光は二峰性ナノラベル (比色 + 蛍光) として機能し、LFA を代表する生物学的アッセイにおいて超高感度検出を提供します。

次に、LFA フォーマットでのプラズモニック蛍光と AuNP の性能を比較するために、非常に高い結合親和性を示すことが知られている、よく特徴付けられているビオチン – ストレプトアビジン複合体ペアリングを使用しました 39。 AuNP とプラズモニック蛍光の両方をストレプトアビジンで官能化し、ビオチン化ウシ血清アルブミン (BSA) を捕捉リガンドとして使用しました。 次に、LFA ストリップを、さまざまな既知濃度のストレプトアビジン結合 AuNP とプラズモニック蛍光に 20 分間さらしました（補足図 5）。 ナノラベルは毛細管力によってニトロセルロース膜に沿って流れ、捕捉リガンドによって捕捉され、テストスポットにナノ粒子が蓄積します。 十分な数のナノラベルが蓄積すると、テスト部位の色が赤色に変わり、陽性結果と標的分析物の存在が示されます。 AuNPを使用したテスト部位での比色信号の平均グレースケール強度とプラズモニック蛍光を使用した蛍光信号は、ナノラベルの濃度とともに単調増加しました（図1g、h）。 特に、AuNP とプラズモニック蛍光の両方について、識別可能な可視信号を生成するには約 107 個のナノ粒子が必要です。 ただし、検出可能な蛍光シグナルを生成するには、約 103 個のプラズモニック蛍光だけで十分です。 LFA フォーマットの AuNP と比較して、プラズモニック蛍光による検出可能なシグナルの濃度閾値が 4 桁低いことは、上で説明したドロップ キャスティング アプローチと一致しています。 これらの結果は、プラズモニック蛍光が、LFA 内の標的分析物の超高感度検出のための超高輝度ナノラベルとして機能できるという基本的な基礎を確立します。

捕捉リガンドとナノラベルの濃度を調整することで、LFA の生物分析性能を最適化しました。 モデルシステムとしてビオチン-ストレプトアビジンを使用しました。 AuNP とプラズモニック蛍光は両方ともビオチン修飾されていました。 ストレプトアビジンとビオチン化BSAは、それぞれ標的分析物と捕捉リガンドとして利用されました（補足図6）。 捕捉リガンド（つまり、ビオチン化BSA）の濃度が増加するにつれて、AuNP（補足図7）およびプラズモン蛍光（補足図8）に対応するテストスポットの平均グレースケール強度と蛍光強度の両方が増加することが観察されました。それぞれ増加しました。 これらの結果は、捕捉リガンドの濃度が高いほどシグナル強度が向上することを示唆しています。 さらに、ナノラベルの数が増加するにつれて、AuNP（補足図9）およびプラズモニック蛍光（補足図10）に対応するテストスポットの平均グレースケール強度と蛍光強度の両方が増加し、数が増えるほど信号強度が向上することを意味します。ナノラベルの。 ただし、どちらの場合も、バックグラウンドシグナル (捕捉スポットの外側の LFA ストリップからのシグナル) もナノラベルの数とともに増加しました。 したがって、AuNPs ベースの LFA と p-LFA の両方に対する最適なナノラベルの数は、テスト スポット シグナルからバックグラウンド シグナルを差し引くことによって決定されました。 予想通り、プラズモン蛍光の最適数 (1.2 × 106) は、AuNP の最適数 (1.78 × 1010) よりも 4 桁少なかった。

次に、ビオチン - ストレプトアビジン AuNP ベースの LFA と p-LFA の生物分析パラメーター (LOD、定量限界 (LOQ)、およびダイナミック レンジ) を比較しました。 AuNPとプラズモニック蛍光の両方からのLFAストリップの8ビットImageJ処理画像から得られた比色信号は、同様のLODを示し、p-LFAの視覚検出能力に損失がないことを示唆していることは注目に値します（補足図11）。 比色LFAのLOD（ブランクの平均+ 3σとして定義、σは標準偏差）は4.8 ng ml-1と計算されました（補足図12、5パラメーターロジスティック）。 対照的に、蛍光分析 p-LFA は 2.3 pg ml-1 までの検出を可能にし (補足​​図 13、5 パラメーター ロジスティック フィット)、LOD が約 2,000 倍向上したことを示しています。 蛍光分析 p-LFA の LOQ (ブランクの平均 + 10σ として定義) は、比色分析 LFA の LOQ よりも約 2,500 倍優れています。 さらに、プラズモン蛍光の蛍光成分により、アッセイのダイナミック レンジが 3 桁拡大されました。 したがって、プラズモニック蛍光の超高輝度蛍光信号により、p-LFA は、はるかに広い範囲の検体濃度にわたって標的検体の超高感度検出を可能にします。

サイトカインは、細胞シグナル伝達と免疫調節に関与する小さな (5 ～ 26 kDa) タンパク質であり、健康と病気の重要な指標です 40。 がん、敗血症、ヒト免疫不全ウイルス、慢性炎症、自己免疫疾患などのいくつかの疾患は、免疫系の調節不全に関連しており、炎症誘発性サイトカインと抗炎症性サイトカインの間の微妙なバランスの崩壊につながることが知られています41,42。 炎症促進性サイトカインには、IL-1、IL-6、IL-12、腫瘍壊死因子-α、インターフェロン-γが含まれ、抗炎症性サイトカインにはトランスフォーミング成長因子-β、IL-10、IL-4が含まれます。 血清サイトカインの分析による免疫状態の迅速なモニタリングとこれらの疾患の早期診断は、迅速な臨床介入と疾患の進行の抑制に不可欠です。 IL-6 検出用の LFA は最近導入されましたが 43,44、ゴールドスタンダード ELISA に匹敵する感度と定量を提供するものはありません。 したがって、我々は、p-LFA の適用性を調査するためのモデル標的分析物として IL-6 を使用しました。

ヒトIL-6捕捉抗体とヒツジ抗免疫グロブリンG（IgG）抗体をニトロセルロース膜上に固定化し、それぞれテストスポットとコントロールスポットを形成しました（図2aおよび補足図14）。 AuNPベースの比色LFA（図2b）および分子蛍光体ベースのLFAのLODは、166 pg ml-1（図2c、5パラメーターロジスティックフィット）および362 pg ml-1（補足図）と計算されました。 15)、それぞれ。 対照的に、蛍光分析p-LFA（図2d）は、93 fg ml-1までの検出を可能にしました（図2e、5パラメーターロジスティックフィット）。これは、従来のAuNPと比較してLODが1​​,785倍向上していることを示しています。ベースの LFA であり、以前に報告された LFA よりも少なくとも 1 桁高いです43、44、45、46。 蛍光分析の p-LFA の LOQ (298 fg ml-1) は、比色分析の LFA の LOQ (682 pg ml-1) より 2,288 倍優れています。 さらに、プラズモン蛍光により、LFA のダイナミック レンジが 3 桁近く改善されました。 AuNPとp-LFAの両方からの比色シグナルは同様のLODを示し、p-LFAの視覚検出能力が失われていないことを示唆しています（図2f、gおよび補足図16）。 さらに、プラズモニック蛍光からの蛍光シグナルにより、はるかに広い範囲の検体濃度にわたって超高感度検出と定量分析が可能になりました（図2e、h）。

a、IL-6捕捉抗体テストスポットとヒツジIgGコントロールスポットを含むIL-6 LFAストリップの概略図。 b、c、これらのAuNPベースのLFAから取得された、AuNPベースのIL-6 LFA（b）および異なるIL-6濃度に対応する用量依存性平均グレー値（c）の概略図。 d、e IL-6 p-LFAの概略図（d）およびIL-6 p-LFAの用量依存性蛍光強度（e）。 f、g、AuNPベースのIL-6 LFA（f）およびIL-6 p-LFA（g）の8ビットのImageJ処理画像。視覚読み出しモードを示しています。 h、蛍光読み出しモードを示すIL-6 p-LFAストリップの蛍光画像。 i、ELISA、p-FLISA、および p-LFA の RMC 曲線 (計算については補足情報を参照)。 破線は、μ = 2 およびμ = 5 での RMC カットオフを示します。 破線と RMC 曲線の交点は、アッセイの特定の定量的性能が達成される濃度の範囲を示します。 IL-6 p-LFA の場合、0.13 ～ 86.0 pg ml-1 の濃度範囲にわたって μ < 2 であり、IL-6 p-LFA がその範囲内で少なくとも 100% 異なる任意の 2 つの濃度に対応するシグナルを区別できることを示唆しています。少なくとも 99% の信頼性があります。 関連する RMC パラメーターを補足表 1 に示します。j、7 か月にわたる IL-6 p-LFA の安定性。これは、7 日間にわたって得られた 4 つの異なる標準曲線を使用して推定された IL-6 濃度の濃度推定値の誤差によって証明されています。数か月。 回路図は BioRender.com で作成されました。

また、蛍光分析 p-LFA の感度と LOD を、ゴールドスタンダード ELISA およびマイクロタイター プレート上で実装されたプラズモニック蛍光免疫吸着アッセイ (p-FLISA) と比較しました (補足図 17)。 p-LFAのLODは、従来のサンドイッチELISA（2.9 pg ml-1）と比較してほぼ30倍低く、p-FLISA（16.8 fg ml-1）のLODよりわずか5倍低いだけです（補足図18）。 ただし、p-LFA のサンプルから回答までの時間は 20 分でしたが、ELISA と p-FLISA では 4 時間を必要とします。

ヒト IL-6 の濃度変化を正確に分解する蛍光分析 p-LFA の能力を評価するために、分析対象物濃度の変化を統計的有意性で区別できるかどうかを示す最近導入された測定基準である分子濃度分解能 (RMC) を定量化しました 47。 この測定基準は LOD を補完するものです。低い LOD はバックグラウンドと区別できる最小の分析対象物濃度を表しますが、RMC は 99% の確実性で識別できる最小の濃度変化倍数を表します 47。 ヒト IL-6 の濃度の 2 倍の変化の分解能について、ELISA、p-FLISA、および p-LFA の RMC を比較しました (RMC パラメーター μ = 2、つまり濃度の 2 倍の変化を分解できることを意味します)。 p-LFAのRMC曲線は、0.13〜86.1 pg ml-1の濃度範囲にわたってμ ≤ 2を示し、ELISAの曲線よりも2桁低く（図2i）、p-FLISAの曲線とほぼ同一でした。 これは、IL-6 p-LFA が、その範囲内で少なくとも 100% 異なる 2 つの濃度に対応するシグナルを少なくとも 99% の信頼度で区別できることを示唆しています。 補足表 1 にリストされている p-FLISA および p-LFA の RMC 機能およびその他の生物分析パラメーターは、20 分間の POC 互換 p-LFA の性能が 4 時間のラボベースの p-FLISA とほぼ同一であることを示しています。

次に、標準を使用せずに定量的検出のための蛍光分析 p-LFA の安定性を確立するために、複数の IL-6 標準曲線が 7 か月にわたって取得されました (補足図 19)。 すべての標準曲線は同様の RMC (補足図 20) および生物分析パラメーターを達成し、優れた再現性と再現性を示唆しています。 これらの標準曲線を使用して、1 pg ml-1 から 50 pg ml-1 の範囲の IL-6 濃度が 20% 未満の偏差で定量されました (図 2j および補足図 21)。

全体として、POC アッセイは研究室ベースのアッセイに匹敵する性能を示し、標準物質を使用しない方法で分析対象物の濃度を正確に定量できる能力を示しました。 これはLFA技術ではこれまで報告されておらず、p-LFAがLFAの長年の限界（実験室試験と比較して感度の限界、精度の低さ、分析範囲の狭さ、定量能力の限界）を克服していることを裏付けるものである。

p-LFA の臨床翻訳の可能性を評価するために、次に SARS-CoV-2 抗体の検出用に p-LFA を最適化しました。 疫学研究と SARS-CoV-23、20 に対するワクチンの有効性に関する研究の両方において、SARS-CoV-2 の高感度で迅速な POC 血清学的アッセイに対する緊急の必要性が続いています。 いくつかの LFA3、4、48 およびその他のアッセイ法 49 では、SARS-CoV-2 抗体を検出するための認識要素として SARS-CoV-2 スパイクタンパク質が使用されています。 p-LFA を使用することで、感度と LOD を現在のアッセイで可能な範囲を超えて ELISA の範囲まで拡張することが私たちの目標でした。

スパイクタンパク質の組換えSARS-CoV-2 S1サブユニットをテストスポットに固定化し、ヒツジIgGを対照スポットに使用しました（図3aおよび補足図22）。 まず、SARS-CoV-2 S1抗体の検出のためのAuNPベースのLFA（図3b）およびp-LFA（図3d）の生物分析パラメーターを決定しました。 LFA ストリップから得られた比色シグナルを使用して、AuNP ベースの LFA の LOD は約 1.05 μg ml-1 であると決定されました（図 3c）。 対照的に、蛍光分析p-LFAは185 pg ml-1のLODを示し(図3e、5パラメーターのロジスティックフィット)、これはほぼ5,675倍の改善を表します。 さらに、予想通り、AuNPとp-LFAの両方から得られた平均グレースケール強度は同様の感度を示し、視覚検出能力に妥協がないことを示唆しました（図3f、gおよび補足図23）。 ただし、プラズモニック蛍光からの蛍光シグナルにより、はるかに広い（4桁高い）検体濃度範囲にわたって超高感度検出と定量分析が可能になりました（図3e、h）。 蛍光分析による p-LFA は、従来のサンドイッチ ELISA と比較して LOD が 165 倍向上し (図 3i)、p-FLISA と同等の LOD (図 3j) を示しました。

a、試験スポットに捕捉要素として組換えSARS-CoV-2 S1タンパク質を含み、対照スポットにヒツジIgGを含むSARS-CoV-2 S1抗体LFAストリップの概略図。 b、d、AuNPベースのSARS-CoV-2 S1抗体LFA（b）およびプラズモン蛍光SARS-CoV-2 S1抗体LFA（d）の概略図。 c、AuNPベースのLFAから取得した、さまざまな濃度のSARS-CoV-2 S1抗体に対応する用量依存性の平均グレー値。 e、20分で実行されたSARS-CoV-2 S1抗体p-LFAの用量依存性SNR比。 f、g、AuNPベースのSARS-CoV-2 S1抗体LFA（f）およびSARS-CoV-2 S1抗体p-LFA（g）の8ビットImageJ処理画像。視覚読み出しモードを示しています。 h、SARS-CoV-2 S1 抗体 p-LFA ストリップの蛍光画像。蛍光読み出しモードを示しています。 i、j マイクロタイタープレート上に実装された標準的なELISA（i）およびp-FLISA（j）によって4時間で実行された、さまざまなSARS-CoV-2 S1抗体濃度に対応する用量依存の光学密度および蛍光強度。 回路図は BioRender.com で作成されました。

蛍光定量的 p-LFA の翻訳可能性を評価するために、我々は、新型コロナウイルス感染症陽性者から得られた 79 個の血漿サンプルと、新型コロナウイルス感染症以前 (2019 年 3 月から 10 月) に収集された 48 個のアーカイブされた匿名化された血清または血漿サンプルをテストしました。 SARS-CoV-2 S1 抗体の存在。 127 個の血漿サンプルすべてを 500 倍に希釈し、蛍光分析 p-LFA を使用してテストしました。 79 個の IgG 陽性サンプル (ELISA で陽性と判定された) のうち、76 個が p-LFA で陽性と判定され (サンプルの信号対雑音比 (SNR) ≧ ブランク SNR + ブランクの 3σ)、感度 96.2% を示しました。 新型コロナウイルス感染症以前のすべてのサンプルは、SARS-CoV-2 S1 IgG の LFA 検査で陰性であり、100% の特異性を示しました (補足表 2)。 したがって、SARS-CoV-2 抗体検出用の p-LFA は、ゴールドスタンダード ELISA に匹敵する精度で POC への適用性を提供し、ワクチンの有効性や疫学研究への潜在的な適用性を提供します。

次に、高感度かつ特異的な POC SARS-CoV-2 抗原検査の重要なニーズを満たす p-LFA の可能性を評価しました。 ウイルス特異的免疫グロブリンの血清学的検査では、ウイルス抗原に対する抗体反応は通常、感染後期（ウイルス暴露後 7 ～ 14 日）に検出されます。 したがって、血清学的抗体検査では、無症候性集団や感染の初期段階を正確にスクリーニングすることはできません51。 さらに、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）診断における現在のゴールドスタンダードであるRT-PCRは、SARS-CoV-2ウイルスに感染した個人を特定することに非常に成功していることが証明されている。 ただし、感染性患者と非感染性個人を区別できない可能性があり、患者が病気から回復した後でも数か月間偽陽性結果が得られる可能性があります52,53。

抗原はウイルスが活発に複製しているときにのみ発現するため、抗原ベースの検査はRT-PCRによるRNA検出よりも感染性との相関が高い可能性があります。 新型コロナウイルス感染症（COVID-19）を診断するための現在の抗原検出検査は拡張可能で便利ですが、精度が低く範囲が広いため制限があります54、55、56、57。 SARS-CoV-2 抗原検出用の LFA は、使いやすさ、低コスト、感染力との良好な相関性により、感染症の流行に対処する上で最も重要なツールとなり得ます。 現在、いくつかの LFA ベースの抗原 6,7,58 アッセイが報告され、広く使用されていますが、最適な感度を提供するものはありません 59。 したがって、症状のある患者においてこのようなアッセイで陰性結果が得られた場合は、確認のための RT-PCR 検査または頻繁な再検査が必要です。 したがって、RT-PCR 法と同じくらい信頼性があり正確な、より高感度な POC 抗原アッセイが緊急に必要とされています。

p-LFA は、PCR 検査を同時に実施した患者からのサンプルにおいて、これに必要な精度と感度を提供しました。 私たちのテストは、SARS-CoV-2 N タンパク質の検出に焦点を当てました。 LFAストリップ上のテストスポットとコントロールスポットは、それぞれNタンパク質捕捉抗体とヒツジIgGを固定化することによって調製されました（図4aおよび補足図24）。 p-LFAから得られた比色シグナルと蛍光シグナルは両方とも、Nタンパク質標準の濃度の増加とともに単調に増加しました（図4b、c）。 ただし、蛍光分析p-LFAのLODおよびLOQは、比色分析の対応物よりもほぼ400倍優れていることが計算され、超高輝度蛍光ナノラベルとしてのプラズモニック蛍光の重要性が確認されました（図4d）。 さらに、蛍光分析p-LFAは、従来のサンドイッチELISAと比較してLODが37倍向上し、p-FLISAと同等のLODを示しました（図4eおよび補足図25）。

a、試験スポットとしてのNタンパク質捕捉抗体および対照スポットとしてのヒツジIgGを含むNタンパク質p-LFAストリップの概略図。 b、c、N タンパク質検出のための p-LFA の比色分析 (b) および蛍光分析 (c) 読み取りモード。 d、比色p-LFAから取得したNタンパク質の異なる濃度に対応する用量依存性平均グレー値（黒）および20分間に実行されたNタンパク質蛍光定量p-LFAの用量依存性SNR（赤）。 e、マイクロタイタープレート上に実装された標準ELISA（黒）およびp-FLISA（赤）によって4時間で得られた、さまざまなNタンパク質濃度に対応する用量依存の光学密度および蛍光強度。 f、蛍光分析 p-LFA (赤) と市販の POC 迅速抗原キット (BD Veritor) (黒) の比較。 g、比色 p-LFA (灰色)、蛍光 p-LFA (黒色)、および BD Veritor によって測定された、PCR 陽性 NP 綿棒サンプル (野生型 SARS-CoV-2) の N タンパク質 SNR。 h. 35 の PCR 陽性サンプル（19 野生型 SARS-CoV-2 および 16 デルタ変異体）。 ND、検出されません。 i、NP 綿棒サンプルの N タンパク質 SNR の検査では、新型コロナウイルス感染症については陰性であり、さまざまな季節性コロナウイルスおよびその他の呼吸器ウイルスについては陽性でした。 回路図は BioRender.com で作成されました。

次に、既存の市販の米国食品医薬品局 (FDA) 緊急使用許可により承認された迅速な POC 抗原検査法に対する p-LFA の利点を実証するために、p-LFA の分析感度を BD Veritor アッセイと比較しました。 50 ng ml-1未満の濃度のサンプルは「推定陰性」として扱われます（図4f）。 これは、蛍光分析 p-LFA が市販の抗原検査と比較してほぼ 235 倍優れた分析感度を提供することを意味します。 p-LFA は、PCR 陽性の COVID-19 患者サンプル (野生型 SARS-CoV-2) を分析する際に、FDA 承認の BD Veritor 抗原キットよりも優れた性能を示しました。 BD Veritor 抗原キットと比色 p-LFA は、PCR 陽性 NP スワブ サンプル 19 個中 8 個を正確に識別しました (分析感度、42.1%)。一方、蛍光定量的 p-LFA は、19 サンプル中 18 個を正確に識別しました (分析感度、94.7%) (図.4g）。 病気の初期段階（症状発現から10日以内）の患者サンプル14件中13件が蛍光p-LFA検査で陽性反応を示した（感度93％）一方、BD Veritorでは7件のみが陽性反応を示した（感度50％）（補足表） 3)。 特に、FDA 承認の BD Veritor 抗原キットは、ネガティブ/ポジティブ形式でのみ使用できます。 ただし、蛍光分析 p-LFA により、患者サンプル中の標的分析物の定量的検出が可能になりました (補足表 4)。 また、比色分析と蛍光分析の p-LFA の定量的性能も比較しました。 比色 p-LFA では 19 サンプル中 3 サンプルのみが定量可能（LOQ 以上）でしたが、蛍光分析 p-LFA では 19 サンプル中 18 サンプルが定量可能でした（図 4h）。

N タンパク質の検出における蛍光分析 p-LFA の臨床翻訳可能性をさらに実証するために、16 個の PCR 陽性 Delta B.1.617.2 変異体 (遺伝子配列決定によって確認された) NP 綿棒患者サンプルをテストしました。 比色 p-LFA は、16 個のデルタ変異体陽性サンプルのうち 7 個で N タンパク質を検出しましたが、定量できたのは 3 個だけでした。 ただし、蛍光分析 p-LFA は 16 サンプルすべてで N タンパク質を検出し、そのうち 15 サンプルが定量可能でした（LOQ 以上）（図 4h、補足図 26、および補足表 5）。 また、17 個の PCR 陽性 Omicron BA.1 (遺伝子配列決定によって確認された) サンプルをテストし、蛍光分析 p-LFA が 17 個の Omicron 変異体サンプルのうち 16 個で陽性結果を返したことを観察しました (補足図 27 および補足表 6)。 すべてのオミクロン陽性患者のサンプルは、症状の発症から短期間（1 ～ 2 日）以内に収集され、1 人を除くすべての患者は非常に軽度の症状を示していました（補足表 7）。 これらの発見は、N タンパク質の早期検出に対する p-LFA の有効性を確立します。

合計 52 の PCR 陽性サンプルが検査されました。 比色 p-LFA では 52 人中 15 人だけが陽性結果を返し、臨床感度 28.8% を示しましたが、蛍光 p-LFA では 52 人中 50 人が陽性反応を示し (SNR > 平均 + 3σ)、分析感度 96.2% を示しました。 ウイルス量が低いサンプル (サイクル閾値 (CT) 値 ≥25) に対する p-LFA の診断感度は 91.7% (12 個中 11 個) であり、ウイルス量が高いサンプル (CT 値 <25) に対する p-LFA の診断感度は 97.5% でした ( 40 点中 39 点）。 この診断感度は、以前に報告された抗原/POC SARS-CoV-2 迅速検査の感度よりも大幅に高かった（CT 値が 25 未満のサンプルでは約 80%、CT 値が 25 以上のサンプルでは 20 ～ 40%）7,59,60 、61。

最後に、SARS-CoV-2 N タンパク質に対する p-LFA の特異性を評価するために、19 個の PCR 陰性 NP 綿棒サンプルをテストしました。 陰性の NP 綿棒サンプルには、健康なサンプルと、季節性コロナウイルスやその他の呼吸器ウイルスの検査で陽性と判定されたサンプルが混合されていました。 19のPCR陰性サンプルはすべて、p-LFAを使用した検査で陰性（SNR <ブランクの平均+ 3σ）であり、COVID-19 Nタンパク質に対する100％の分析特異性と、さまざまな季節性コロナウイルスや他のウイルスとの交差反応性がないことを示唆しています（図4i） ）。 これらの結果は、p-LFA により、新型コロナウイルス感染症の抗原と抗体の超高感度、正確、迅速、安価な POC 診断が可能となり、症候性および無症候性の感染症を迅速かつ定量的に診断するための潜在的なツールとなり得ることを実証しています。

最後に、POC 設定におけるこの生物診断技術の適用可能性を判断するために、ポータブルで安価な蛍光スキャナーを使用して p-LFA のパフォーマンスを検証しました。 プラズモニック蛍光に対応するストークス シフトは、量子ドットやユーロピウム ナノ粒子 (数百ナノメートル) などの一般的に使用される蛍光ナノ粒子に対応するストークス シフトよりもはるかに小さい (約 15 nm) ことに注意してください。 私たちの知る限り、プラズモニック蛍光と互換性のある安価なポータブル蛍光スキャナーは市販されていません。 そこで、プラズモン蛍光をナノラベルとして使用して p-LFA を読み取るための安価なポータブル蛍光スキャナーを開発しました。 寸法 25 × 25 × 19 cm (L × B × H) のスキャナのプロトタイプは、日常的に入手可能な既製の光学コンポーネントを使用して構築されました (詳細については、「方法」を参照。図 5a および補足図 28)。 。 スキャナーの総コストは 1,429 米ドルで、最も高価なコンポーネントはレーザーで、919 米ドルです。 この研究で説明されているすべての測定では、蛍光信号の飽和を避けるためにレーザー (励起源) 出力が最大出力の 1% に設定されていることは注目に値します。 したがって、これらのコンポーネントを小型化し、より安価なコンポーネントに置き換えて商品化することができます。 また、ポータブル スキャナはバッテリで動作するため、リソースが限られた環境でもすぐに導入できます。

a、ポータブル蛍光スキャナーの写真。 b. 研究で使用した LFA カセットと p-LFA のワークフローの概略図。 S、T、C はそれぞれサンプル パッド、テスト ライン、コントロール ラインに対応します。 青い矢印は、ポータブル スキャナーを使用して LFA カセット上で行われた蛍光測定の方向を表します。 c、ポータブル スキャナを使用して取得された代表的な正 (黒) 信号と負 (赤) 信号。 d. 異なる濃度のプラズモニック蛍光をドロップキャストし、ベンチトップスキャナーとポータブルスキャナーを使用してスキャンした、LFA ストリップから得られた蛍光強度 (黒い球) と曲線下面積 (赤い球) の値。 e、視覚読み出しモードを示すフルストリップ IL-6 比色 p-LFA の 8 ビット ImageJ 処理画像。 f、蛍光読み出しモードを示すフルストリップIL-6蛍光測定p-LFAの蛍光画像。 g、ベンチトップスキャナー（黒）およびポータブルスキャナー（赤）によって測定された15分間のIL-6蛍光分析p-LFAの用量依存性シグナル。 h、蛍光分析p-LFAによって決定され、ベンチトップスキャナーおよびポータブルスキャナーを使用して測定された、血清サンプル中のIL-6濃度の線形回帰プロット。 i、15分間の蛍光分析p-LFAおよびポータブルスキャナーを使用して行われた測定値と比較した、4時間のラボベースのp-FLISAおよびベンチトップ蛍光スキャナーによって測定された血清サンプル中のIL-6濃度の線形回帰プロット。 j、蛍光分析 p-LFA によって決定され、ベンチトップおよびポータブル スキャナーを使用して測定された NP スワブ サンプル中の N タンパク質濃度の線形回帰プロット。 データは平均値±標準偏差です。 n = 2 × 2 回の繰り返しテスト。 回路図は BioRender.com で作成されました。

我々は、テストメンブレンと吸収パッドとともに、個別のサンプルパッドとコンジュゲートパッドを備えたフルストリップ LFA を製造しました。 組み立てられたストリップは、標準のLFAカセットに埋め込まれました（図5bおよび補足図29）。 蛍光測定は、トラベルアクチュエータを使用してカセットをポータブルスキャナの光学系に沿って図5bの青い矢印の方向に移動させることによって実行されました。 これにより、100 μm 刻みで取得した、テスト膜の移動長に対する 10 枚の画像から平均化されたピクセル値 (信号強度) のトレースが生成されました (図 5c)。 したがって、有効な陽性結果にはテスト ラインとコントロール ラインにピークがあり、陰性結果にはコントロール ラインのみにピークがあります。 コントロールラインにピークがないテストは無効な結果とみなされます（補足図30）。

まず、ポータブル スキャナの性能をベンチトップ スキャナと比較するために、各スキャナで検出できるナノラベルの最小数を決定しました。 段階希釈したプラズモニック蛍光体（図5dおよび補足図31）と既知の濃度の800個のCW分子蛍光体（補足図32および33）をテスト膜上にドロップキャストした場合、生成するには約100個のプラズモニック蛍光体の蓄積が必要でした。ベンチトップスキャナを使用して測定した場合の検出可能な蛍光強度（ブランクの平均+ 3σ）、ポータブルスキャナには〜200のプラズモニック蛍光が必要でした（図5d）。 ベンチトップまたはポータブルスキャナのいずれかを使用して測定した場合に検出可能な蛍光強度を生成するには、約 0.6 × 106 分子の蛍光色素分子 (プラズモン増強されていない) の蓄積が必要でした。 ポータブルスキャナによって取得されたデータとその後のデータ処理方法については、補足情報で詳細に説明されています（補足図34および35）。 これらの観察は、プラズモニック蛍光からの蛍光信号の検出において、ベンチトップ スキャナとポータブル スキャナの性能がほぼ同じであることを示しています。

次に、p-LFA の POC 互換ワークフローを実証し、ポータブル スキャナーとベンチトップ スキャナーのパフォーマンスを比較するために、モデル分析物としてヒト IL-6 を使用しました。 ヒトIL-6捕捉抗体とヒツジ抗IgG抗体をニトロセルロース膜に印刷して、それぞれテストラインとコントロールラインを形成しました（補足図36）。 フルストリップ形式の比色IL-6 p-LFAのLOD（図5e）は、〜526 pg ml-1と計算されました（補足図37）。 対照的に、蛍光分析p-LFA（図5fおよび補足図38）は、ベンチトップスキャナーを使用して測定した813 fg ml-1（図5gの黒色、5パラメーターロジスティックフィット）までの検出を可能にしました。 注目すべきことに、ポータブルスキャナでは、IL-6 p-LFAは同様のLOD、916 fg ml-1を示しました（図5gの赤色、5パラメータロジスティックフィット）。 ベンチトップスキャナとポータブルスキャナのほぼ同一の性能は、Nタンパク質の用量反応曲線を比較することによってさらに確認されました（拡張データ図1および補足図39および40）。 フルストリップ LFA の LOD は、分析物の結合に利用できる時間が短く（15 分対 20 分）、分析物の量が少ない（70 μl 対 100 μl）ため、上で説明したハーフストリップ形式と比較して高いことに注意してください。フルストリップ形式でキャプチャー抗体結合ナノラベルに変換します。

最後に、臨床翻訳の可能性と、ポータブルスキャナーを使用したp-LFAのPOC応用の可能性を実証するために、IL-6の検出について、COVID-19 PCR陽性個人からの28の血清と14のNP綿棒サンプルをテストしました（拡張データ図。それぞれ、2および3）およびNタンパク質（補足図41および42）。 これらのサンプルは 15 分間の p-LFA によってテストされ、ベンチトップおよびポータブル スキャナーを使用して測定されました。 ベンチトップおよびポータブルスキャナからの定量結果は、IL-6のピアソンr値0.97（図5h）およびNタンパク質濃度の0.94（図5jおよび補足表8）との優れた相関関係を示しました。 同様に重要なことは、15 分間の p-LFA によって測定され、ポータブル スキャナーによって測定された IL-6 濃度も、4 時間の実験室ベースの p-FLISA によって測定されたものと優れた相関関係を示しました (ピアソンの r 値 0.91) (図 1)。 5i および補足表 9)。

この観察は、ベンチトップスキャナーとポータブルスキャナーを使用して生成された IL-6 および N タンパク質の p-LFA 標準曲線のほぼ同一の生物分析パラメーターとともに、p-LFA の感度と定量的検出能力が使用によって損なわれないことを示唆しています。安価でポータブルな蛍光スキャナーです。 このポータブル スキャナを使用した結果は、高価な非ポータブル ベンチトップ蛍光スキャナを使用して実行された 4 時間の研究室ベースのテストで得られた結果と同等でした。 これらの結果は、p-LFA のシンプルなワークフローと、POC 設定における生物診断における p-LFA の可能性を強調しています。

要約すると、我々は、プラズモン蛍光が、LFA の長年の限界を克服するための二峰性 (比色 + 蛍光) レポーター要素として機能できることを示しました。 具体的には、p-LFA は、臨床検査と比較した場合、LFA の限られた感度、低い精度、小さなダイナミック レンジ、および限られた定量能力を克服します。 プラズモニック蛍光は、従来の比色分析用 AuNP で必要とされる密度よりも 10,000 倍低い密度で識別可能な蛍光シグナルを生成しました。 さまざまな分析物 (IL-6、SARS-CoV-2 S1 抗体、および SARS-CoV-2 抗原) に対する p-LFA は、従来の LFA と比較して生物分析パラメーター (LOD、LOQ、およびダイナミック レンジ) において約 1,000 倍の向上を示しました。 p-LFA は、ゴールドスタンダード ELISA よりも 10 倍以上優れた感度を備えたスタンダードフリーの定量的検出を提供し、サンプルから応答までの時間がはるかに短く (4 ～ 6 時間に対して 20 分)、分子濃度を分解する能力も同様でした。ラボベースのテストとして。 血漿および NP 綿棒サンプル中に存在する COVID-19 抗体および抗原を検出するための p-LFA は、>95% の感度と 100% の特異性を達成し、臨床応用可能性を示しました。 私たちが開発し、p-LFA を読み取るために最適化された安価でポータブルな蛍光スキャナーは、使用したベンチトップ スキャナーと同じくらい効果的でした。 新型コロナウイルス感染症陽性者のヒト検体に適用した場合、ベンチトップスキャナーとポータブルスキャナーを使用して 15 分間 p-LFA で測定された IL-6 および N タンパク質の濃度は、相互に優れた相関関係を示し、また実験室ベースのスキャナーで測定された濃度とも優れた相関関係を示しました。 4時間のp-FLISA。 私たちは、p-LFA は、生体分析物の正確かつ定量的な検出を必要とする POC 生物診断を実現するのに非常に魅力的であると考えています。 ここで報告された技術は、他の感染性病原体や疾患バイオマーカーの検出に容易に適用でき、病原体感染やその他の急性症状の診断のための臨床検査ベースの検査を補完または置き換えることさえできる可能性があります。

プラズモニック蛍光は、プラズモン活性コア、シード媒介法64によって合成されたAuNR、ポリマースペーサー層、蛍光色素分子、および普遍的な生体認識要素（ビオチン）から構成されます。 プラズモン蛍光は、我々の以前の研究で説明したのと同様の手順に従って合成されました27。 詳細な段階的な手順については、補足情報で説明します。

クエン酸で安定化された AuNP は、シード媒介合成法を使用し、還元剤としてクエン酸を使用して合成されました。 Au シード (約 15 nm) は、参考文献によって以前に説明されているように合成されました。 65. 簡単に説明すると、20 mlの0.25 mM HAuCl4 (Sigma Aldrich、520918) を800 rpmで激しく撹拌しながら沸騰させた。 溶液が沸騰し始めた直後、０．２ｍｌの３％（ｗ／ｖ）クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１６１３８５９）水溶液を添加し、溶液の色がワインレッドに変化し、Ａｕシードの形成を示すまで沸騰条件下に維持した。 次に、イオン性金を還元するための還元剤としてヒドロキノン (Sigma Aldrich、H9003) を使用して、約 100 nm の AuNP を合成しました。

透過型電子顕微鏡画像は、JEOL JEM-2100F 電界放出装置を使用して取得されました。 プラズモンナノ構造の消光スペクトルは、Shimadzu UV-1800 分光光度計を使用して取得しました。 蛍光マッピングは、LI-COR Odyssey CLx イメージング システムを使用して記録されました。 平均グレー強度を特徴付けるために、デジタル カメラ (Sony cybershot DSC HX300) とイメージング ソフトウェア ImageJ 1.53e を使用しました。 SpectraMax iD3 (Molecular Devices) プレートリーダーを使用して、ELISA での光学密度を測定しました。

ストレプトアビジン (Sigma Aldrich、SA101) でナノラベルを官能化するには、10 mg ml-1 のストレプトアビジン (または BSA ビオチンまたは検出抗体) 1 μl を OD1 1 ml のナノラベルに添加し、シェーカー上で室温で 1 時間インキュベートしました。 。 粒子を安定化させるために、10 mg ml-1 の BSA (Sigma Aldrich、A7030) 1 μl を溶液に添加し、さらに 20 分間インキュベートしました。 溶液をｐＨ１０のナノ純水（１０ｍｌの水中に１μｌのＮａＯＨ）で４回洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。 最後に、ナノラベルは、LFA で使用するために 1% BSA を含む 1 × PBS 溶液に再分散されました。 ナノラベルを抗体 (IL-6 および N タンパク質検出抗体および抗ヒト IgG) で官能化するために、同様のプロセスが使用されました。

LFA ストリップの製造には、ニトロセルロース試験膜と粘着性裏地付き吸収性パッド (GE Healthcare、FF120HP) を使用しました。 試験膜と吸収パッドをペーパートリマーを使用して幅 4 mm のストリップに切断しました。 LFA ストリップを準備するために、生体認識要素 (たとえば、捕捉抗体) 溶液を試験膜上にピペットで滴下し、室温で 30 分間乾燥させました。 続いて、１×ＰＢＳ溶液中の３％ＢＳＡを使用して試験膜をブロックした。 次に、ストリップをＰＢＳＴ（１×ＰＢＳおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ９４１６））で洗浄し、続いて真空デシケーター中で室温で１時間乾燥させた。 乾燥後、吸収性パッド（GE Healthcare、CF5）をニトロセルロース試験膜の隣のポリスチレン粘着バッキング上に組み立てた。 テストメンブレンから吸収パッドへの溶液の効率的な移動を確実にするために、両方のストリップの間に 1 ～ 2 mm のオーバーラップを確保しました。 実験は、100 μl のサンプル/標準溶液を満たした 96 ウェル プレートに LFA を 20 分間浸漬することによって実行されました。 LFA の視覚信号はデジタル カメラで取得されました。 画像は、ImageJ を使用して 8 ビット グレースケール画像に変換されました。 テスト スポットの平均グレー値は、ImageJ から得られたテスト スポットのグレースケール強度を平均することによって計算されました。 蛍光シグナルは、以下のスキャン パラメーターを使用して、LI-COR Odyssey CLx 蛍光スキャナーを使用して得られたテスト ドットの蛍光強度を平均することによって得られました。 解像度、21 μm。 チャネル、800 nm。 高さ、0mm。

テストスポット上のビオチン化 BSA の最適濃度を決定するために、さまざまな濃度のビオチン化 BSA (100 μg ml-1 ～ 5 mg ml-1) を含む異なる LFA ストリップを二重に調製しました。 次に、LFA を同じ濃度のストレプトアビジン (AuNP-LFA については 1,000 ng ml-1、p-LFA については 1 ng ml-1) およびビオチン化ナノラベルに曝露しました。 ナノラベルの最適濃度を決定するために、同じ濃度のビオチン化 BSA (5 mg ml-1) を含む LFA ストリップを二重に調製しました。 次に、これらの LFA ストリップを、同じ濃度のストレプトアビジン (AuNP の場合は 1,000 ng ml-1、プラズモニック蛍光の場合は 1 ng ml-1) に曝露しましたが、ビオチン官能化ナノラベルの数は異なります (AuNP の場合は 4.45 × 106 ～ 3.56 × 1010、1.2プラズモン蛍光の場合は × 104 ～ 6 × 106)。 比色分析用 AuNPs-LFA および p-LFA、および蛍光分析用 p-LFA の最適なナノラベル数は、テスト スポット シグナルからバックグラウンド シグナルを差し引くことによって決定されました。

テストスポットは、5 mg ml-1 ビオチン化 BSA 0.5 μl をニトロセルロース膜上にピペットで移すことによって形成されました。 LFA ストリップは上記のように組み立てられました。 AuNP ベースおよびプラズモニック蛍光ベースのビオチン - ストレプトアビジン LFA の場合、それぞれ 1 μl のビオチン化 AuNP および 1 μl のビオチン化プラズモニック蛍光を、99 μl の異なる濃度のストレプトアビジン標準溶液 (0.1 pg ml-1 ～ 1,000 μg ml ) と混合しました。 −１）９６ウェルプレート中でストレプトアビジンとビオチン化ナノラベルとの結合を可能にする。 次いで、２連のＬＦＡストリップをサンプル溶液および標準溶液に２０分間曝露した。

この研究では、ヒト IL-6 DuoSet ELISA キット (R&D Systems、DY206) を利用しました。 AuNP ベースの IL-6 LFA の場合、AuNP は、テスト スポットについては IL-6 検出抗体と結合し、対照スポットについては抗羊 IgG (R&D Systems、BAF016) と結合しました。 p-LFA については、プラズモニック蛍光を試験スポットとして IL-6 検出抗体と結合させ、AuNP を対照スポットとして抗羊 IgG と結合させました。 IL-6 イムノアッセイ用の LFA ストリップを準備するために、2 mg ml-1 IL-6 捕捉抗体 0.5 μl および 2 mg ml-1 羊 IgG (R&D Systems、5-001-A) 0.5 μl をニトロセルロース膜上にピペットで移しました。異なるスポットでテストスポットとコントロールスポットをそれぞれ作成します。 続いて、上記と同様の手順に従って、LFA の準備と組み立てが行われました。 AuNP ベースの IL-6 LFA の場合、テストスポットおよびコントロールスポット用に、IL-6 検出抗体結合 AuNP 1 μl および抗ヒツジ IgG 結合 AuNP 1 μl を、異なる濃度のヒト IL-6 98 μl と混合しました。 96 ウェルプレート内の標準溶液 (64 fg ml-1 ～ 5 ng ml-1) で分析物と検出抗体結合ナノラベルの結合を可能にします。 次いで、２連のＬＦＡストリップをサンプル溶液および標準溶液に２０分間曝露した。 IL-6 p-LFA の場合、1 μl の IL-6 検出抗体結合プラズモン蛍光および 1 μl の抗ヒツジ IgG 結合 AuNP を 98 μl のヒト IL-6 標準溶液 (1 fg ml-1 ～ 1 ng ml) と混合しました。 −1) 96 ウェルプレート。 視覚シグナルおよび蛍光シグナルは、上記の手順に従って取得されました。

ヒト IL-6 ELISA は、DuoSet ELISA キットマニュアルに記載されている手順に従って実行され、補足情報で詳細に説明されています。 p-FLISA は、HRP 標識ストレプトアビジンをストレプトアビジン官能化プラズモニック蛍光に置き換えた点を除き、同様のアプローチを採用して実行されました。 ストレプトアビジン – HRP の代わりに、100 μl のストレプトアビジン – プラズモン蛍光 (OD 1) を 30 分間インキュベートし、その後プレートを PBST で 3 回洗浄しました。 ELISA と p-FLISA は両方とも 2 回実施しました。 蛍光シグナルは、LI-COR Odyssey CLx を使用して次のスキャン パラメータで得られたマイクロタイター ウェルからの蛍光強度を平均することによって得られました。 解像度、169 μm。 チャネル、800 nm。 高さ、4 mm。

4 つの p-LFA IL-6 標準曲線 (1 fg ml-1 ～ 1 ng ml-1) が 6 か月にわたって作成され、さまざまな IL-6 濃度 (0.5 pg ml-1 ～ 62.5 pg ml-1) のサンプルが作成されました。 1) 標準を使用しない方法で二重にテストされました。 実験濃度は各標準曲線を使用して決定され、実際の濃度からの偏差が計算されました。

2 mg ml-1 の組換え SARS-CoV-2 S1 タンパク質 (R&D Systems、10522-CV) 0.5 μl と 2 mg ml-1 の羊 IgG 0.5 μl をそれぞれテストスポットおよびコントロールスポットとしてニトロセルロース膜上にピペットで移しました。 続いて、上記と同じ手順に従って LFA ストリップを準備しました。 SARS-CoV-2 S1 抗体、AuNP-LFA および p-LFA を検出するために、テスト スポットとして、AuNP およびプラズモニック蛍光をそれぞれビオチン化抗ヒト IgG (Rockland、609-4617) と結合させました。 どちらの場合も、AuNP を対照スポットとして抗ヒツジ IgG と結合させました。 AuNP ベースの SARS-CoV-2 S1 抗体 LFA の場合、1 μl の抗ヒト IgG 結合 AuNP および 1 μl の抗羊 IgG 結合 AuNP をさまざまな濃度の標準溶液 (16 pg ml-1 ～ 25 μg ml ) と混合しました。 −１）９６ウェルプレート中、ＬＦＡストリップに２０分間曝露する前。 プラズモン蛍光ベースの SARS-CoV-2 S1 抗体 LFA の場合、1 μl の抗ヒト IgG 結合プラズモニック蛍光および 1 μl の抗羊 IgG 結合 AuNP をさまざまな濃度の標準溶液 (16 pg ml-1 ～ 1 μg ml-1) を 96 ウェルプレートに添加し、その後 LFA ストリップに 20 分間曝露します。 血漿サンプルは、使用前に試薬希釈液 (3% BSA を含む 1 × PBS、0.2 μm 濾過) で 500 倍に希釈しました。 すべての実験は二重に行われました。 視覚シグナルおよび蛍光シグナルは、上記と同じ手順を使用して得られました。

SARS-CoV-2 S1抗体ELISAは以下の手順で実施した。 室温での一晩のインキュベーションにより、2連のマイクロタイターウェルを5μg ml-1（1×PBS中）組換えSARS-CoV-2 S1タンパク質100μlでコーティングした。 ブロッキングのために、300 μl の試薬希釈液をウェルに最低 1 時間添加しました。 次に、段階希釈した標準サンプル 100 μl を 2 時間インキュベートし、続いて 100 ng ml-1 ビオチン化抗ヒト IgG 100 μl を 2 時間インキュベートしました。 次に、100μlの500ng ml-1ストレプトアビジン標識HRP（Thermo Fisher Scientific、N100）を20分間インキュベートし、続いて100μlの基質溶液を20分間添加した。 ５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ９９４）を添加することによって反応を停止させ、直ちにマイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの光学密度を測定した。 p-FLISAは、HRP標識ストレプトアビジンをストレプトアビジン官能化プラズモニック蛍光に置き換えた点を除き、同様の手順を採用して実施した。 HRPの代わりに、100μlのプラズモン蛍光（OD 1）を30分間インキュベートし、その後プレートをPBSTで3回洗浄した。 蛍光シグナルは、LI-COR Odyssey CLx を使用して得られたマイクロタイター ウェルからの蛍光強度を平均することによって得られました。

2 mg ml-1 N タンパク質捕捉抗体 (SinoBiologicals、40143-MM08) 0.5 μl と 2 mg ml-1 羊 IgG 0.5 μl をそれぞれテストスポットおよびコントロールスポットとしてニトロセルロース膜上にピペッティングしました。 N タンパク質 p-LFA の場合、テスト スポット用にプラズモニック蛍光をビオチン化 N タンパク質検出抗体 (SinoBiologicals、40143-R004) と結合させました。 抗ヒツジ IgG と結合した AuNP をコントロール スポットとして使用しました。 続いて、上記と同様の手順に従って、LFA ストリップを準備および組み立てました。 プラズモン蛍光ベースの N タンパク質 LFA の場合、1 μl の検出抗体結合プラズモニック フラワーと 1 μl の抗羊 IgG 結合 AuNP をさまざまな濃度の標準溶液 (12 pg ml-1 および 1 μg ml-1; SinoBiologicals) とインキュベートしました。 、４０５８８−Ｖ０８Ｂ）を、ＬＦＡストリップに２０分間曝露する前に、９６ウェルプレート中のユニバーサル輸送培地（ＵＴＭ）にスパイクした。 p-LFA は、患者の NP 綿棒サンプルに存在する N タンパク質の検出に使用されました。 NP スワブ サンプルは UTM 形式であり、希釈や処理を行わずに使用されました。 すべての実験は二重に実行されました。 視覚信号と蛍光信号は、上記と同じプロセスを使用して取得されました。

Ｎタンパク質ＥＬＩＳＡは、まず、室温で一晩インキュベートすることにより、１００μｌの１００ｎｇ ｍｌ−１ Ｎタンパク質捕捉抗体（１×ＰＢＳ中）でマイクロタイターウェルを二重にコーティングすることによって実施した。 ブロッキングのために、300 μl の試薬希釈液をウェルに最低 1 時間添加しました。 次に、段階希釈した標準サンプル 100 μl を 2 時間インキュベートし、続いて 200 ng ml-1 ビオチン化 N タンパク質検出抗体 100 μl を 2 時間インキュベートしました。 次に、100μlの500ng ml-1ストレプトアビジン標識HRP（Thermo Fisher Scientific、N100）を20分間インキュベートし、続いて100μlの基質溶液を20分間添加した。 ５０μｌの２Ｎ Ｈ ２ ＳＯ ４ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ９９４）を添加することによって反応を停止させ、直ちにマイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの光学密度を測定した。 p-FLISAは、HRP標識ストレプトアビジンをストレプトアビジン官能化プラズモニック蛍光に置き換えた点を除いて、同様の手順を採用することによって実施した。 HRPの代わりに、100μlのプラズモン蛍光（OD 1）を30分間インキュベートし、その後プレートをPBSTで3回洗浄した。 蛍光シグナルは、LI-COR Odyssey CLx を使用して得られたマイクロタイター ウェルからの蛍光強度を平均することによって得られました。

SARS-CoV-2 を迅速に検出するための BD Veritor キット、Veritor System を使用して、患者サンプル中の N タンパク質の存在を分析しました。 BD Veritor システムは、BD Veritor Plus Analyzer と組み合わせて使用​​されました。 NP スワブは UTM および Aimes (ESwab) 輸送媒体で溶出されました。 内部検証とアッセイ精度は、バーンズ ユダヤ臨床微生物研究所によって臨床サンプルの検査に許容されるものと判断されました。

新型コロナウイルス感染症の発生前に収集された血清または血漿サンプルは、HRPO 201102546 に基づいてセントルイスのワシントン大学の人間研究保護局によって承認された研究に基づいて収集されました。研究で使用された臨床サンプルは、唾液、血清のリポジトリから取得されました。 、セントルイスのワシントン大学医学部およびバーンズ・ユダヤ人臨床微生物研究所にある、新型コロナウイルス感染症が確認または疑われる個人からの血漿およびNP綿棒サンプル。 サンプルの取得は、バーンズ・ユダヤ病院財団によって支援されました。 サイトマンがんセンターは、国​​立衛生研究所 (NIH) の国立がん研究所から助成金 P30 CA091842 を取得しています。 およびワシントン大学臨床トランスレーショナルサイエンス研究所は、NIH の国立トランスレーショナルサイエンス推進センター (NCATS) から UL1TR002345 の認可を受けています。 このリポジトリは、Jane O'Halloran 医学博士によって開発され、維持されています。 チャールズ・ゴス博士; とフィリップ・マッド医学博士。 無症候性の健康なボランティアからの対照ＮＰスワブサンプルを、事前の書面による同意を得て入手した。 季節性コロナウイルスとの交差反応性を評価するために、臨床的に保証されたNPサンプル検査により、4つの季節性コロナウイルスまたは呼吸器疾患のいずれかに陽性反応を示したバーンズ・ユダヤ病院の成人からサンプルを採取しました。 ワシントン大学医学部人間研究保護局が研究を承認した。 すべての臨床データはデータ収集時にすでに存在していました。 新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の PCR 結果に関する臨床情報およびデータについては、事前に同意の放棄が得られています。

フルストリップ p-LFA コンポーネントには次のものが含まれます。NC メンブレン、ポリスチレン裏張りの FF80HP (カタログ番号 10547020、Whatman、Cytiva 製)。 サンプルパッド、Fusion 5 (カタログ番号 8151-9915、Whatman、Cytiva 製); コンジュゲートパッド、Whatman Standard 14 (8133-2250、Cytiva); 吸収パッド、CF5 (カタログ番号 8115-2250、Cytiva)。 サンプルパッドとコンジュゲートパッドは次の前処理プロセスにさらされました。サンプルパッドは 5% BSA、0.5% Tween 20、および 1× PBS に浸漬され、37 °C のオーブンで 2 時間乾燥されました。 コンジュゲートパッドを5% BSA、10% スクロース、0.5% Tween 20および1×PBSに浸し、37℃のオーブンで2時間乾燥させました。 前処理後、サンプルパッドとコンジュゲートパッドをそれぞれ 15 mm × 25 mm および 13 mm × 25 mm の寸法のストリップに切断しました。 吸収パッドは受け取ったまま使用し、18 mm × 25 mm の寸法に切断しました。

テストライン用のナノラベルを調製するために、1 mg ml-1 濃度のビオチン化 SARS-CoV-2 N タンパク質またはヒト IL-6 検出抗体 1 ～ 3 μl を、消光 2 のストレプトアビジン官能化プラズモニック蛍光 1 ml に添加しました。 1分間のインキュベーション後、1×PBS中の10％BSA 100μlをこの抗体結合プラズモン蛍光溶液に添加した。 さらに 30 分間インキュベートした後、結合ナノラベル溶液を 3 回遠心分離して未結合の検出抗体を除去し、その後の溶液を 10% スクロースを含む 2 mM ホウ酸ナトリウム、pH 8.5 に再分散させました。 コントロールラインのナノラベルの調製のために、2 mg ml-1 濃度のビオチン化抗ヤギ IgG 1 ～ 5 μl を、吸光度 2 のストレプトアビジン プラズモニック蛍光 1 ml に添加しました。30 分間のインキュベーション後、1 に 10% BSA を 100 μl 加えました。 × この抗体 - プラズモン蛍光複合体溶液に PBS を添加しました。 さらに３０分間インキュベートした後、共役ナノラベル溶液を３回遠心分離し、１０％スクロースからなるｐＨ８．５の２ｍＭホウ酸ナトリウムに再分散させた。

次に、テストラインとコントロールラインのナノラベルを 1:1 の比率で混合しました。 その後、得られた溶液を前処理した複合体パッド上に噴霧した。 試薬ディスペンサー（XYZ Platform Dispenser HM3030、Kinbio）を使用して、ナノラベル溶液を5μl cm-1の分配速度でエアジェットスプレーしました。 スプレーした後、複合パッドを 37 °C のオーブンで 2 時間乾燥させました。 次に、テストラインとコントロールラインに特異的な捕捉抗体をプリントすることによりテストメンブレンを調製しました。 テストラインでは濃度 1 mg ml-1 の SARS-CoV-2 Ag およびヒト IL-6 捕捉抗体、およびコントロールラインでは濃度 2 mg ml-1 のヤギ IgG を FF80HP ニトロセルローステストメンブレン上に 2 の分注速度で同時に印刷しました。試薬ディスペンサー (XYZ Platform Dispenser HM3030、Kinbio) による 0.5 μl cm-1、速度 50 mm s-1。 その後、膜を 37 °C のオーブンで 2 時間乾燥させました。

最後に、前処理したサンプルパッド、ナノラベルを噴霧した後のコンジュゲートパッド、および捕捉抗体を印刷した後のメンブレンパッドを、各パッド間に2 mmの重なりを持たせて組み立て、ストリップカッターを使用して幅3 mmのストリップに切断しました（プログラマブル ストリップ カッター ZQ2002、Kinbio)。 p-LFAの設計の概略図については、補足図45を参照してください。

80 mW 785 nm ダイオード レーザー (Zlaser、Z80M18S3-F-785-pe) を励起源として使用しました。 レーザービームは 1% 減光フィルターで減衰され、レーザー焦点制御と焦点距離 30 mm のシリンダー平凸レンズの組み合わせを使用して幅 4 mm の線に成形されました。 蛍光を焦点距離３０ｍｍの平凸レンズ（直径１２．５ｍｍ）で収集し、８３２／３７ｎｍ発光フィルター（Edmund Optics、84-107）を通過させた。 焦点距離 45 mm の色消しダブレット レンズ (Edmund Optics、49-355) を使用して、カメラ (ZWO ASI462MC) のセンサー上にラテラル フロー ストリップの 1.5 倍の拡大画像を形成しました。 蛍光は励起に対して45°の角度で測定されました。 ラテラルフローカセットからの測定は、カメラビデオをストリーミングしながら、光学システムを通してサンプルを（Actuonix L16-R 50 mmトラベルアクチュエーターを使用して）1 mm s-1で移動させることによって実行されました。 ビデオは 100 ミリ秒の露出で作成されました (1 秒あたり 10 枚の画像)。 10 枚の各画像からの平均ピクセル値が分析に使用され、この機器によって生成されたトレース内の 1 つのポイントに対応しました。 Raspberry Pi 4 シングルボード コンピューターを使用して、機器のすべてのハードウェア コンポーネントを制御しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付ける主なデータは、論文および補足情報で入手できます。 この研究で生成されたすべてのデータは、識別子 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21556365 を介して figshare から入手できます。

RMC μ および RMC パラメーター計算のコード、およびラングミュアおよび 5 パラメーター ロジスティック フィッティングのコードの使用方法に関する説明は、https://github.com/seanwangsalad/PythonRMC で入手できます。 ポータブル スキャナーからのデータを処理するコードとそのコードの使用方法については、https://github.com/seanwangsalad/AreaUnderCurveForLFAReader で入手できます。

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私たちは、国立科学財団 (CBET-2027145、CBET-2029105 および CMMI 1548571) および国立がん研究所の革新的な分子分析技術 (R21CA236652 および R21CA236652-S1) からの支援に感謝します。 この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所 (NIH) の国立トランスレーショナル科学推進センター (NCATS) からのワシントン大学臨床トランスレーショナル科学研究所の助成金 UL1TR002345 によって支援されました。 また、電子顕微鏡施設へのアクセスを提供していただいたワシントン大学のナノ研究施設 (NRF) と材料科学工学研究所 (IMSE) にも感謝します。 図１および図２に示される概略図の一部。 1a、2a、3a、4a、および 5b は BioRender.com で作成されました。 BioRender 画像に関してご協力いただいた H. Baldi に感謝いたします。 有益な議論をしていただいたワシントン大学医学部の MS Diamond、A. Ellebedy、DH Fremont、SPJ Whelan、およびワシントン大学 McKelvey School of Engineering の J. Luan に感謝します。 新型コロナウイルス感染症以前のサンプルをご提供いただきましたワシントン大学医学部の GJ Weil 氏と PU Fischer 氏に感謝いたします。 この研究で使用されたサンプルは、バーンズ・ユダヤ病院財団の支援を受けているワシントン大学医学部の新型コロナウイルス感染症バイオリポジトリから入手したものである。 サイトマンがんセンターは、NIH 国立がん研究所から助成金 P30 CA091842 を取得しています。 ワシントン大学臨床トランスレーショナルサイエンス研究所は、NIH の NCATS から UL1TR002345 の認可を受けています。 このリポジトリは、J. O'Halloran、C. Goss、P. Mudd によって開発され、維持されています。 内容は著者のみの責任であり、必ずしも NIH の見解を表すものではありません。

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学材料科学工学研究所機械工学および材料科学学部

ロヒト・グプタ、プラシャント・グプタ、アヌシュリー・セス、ゼユ・ワン、ガイ・M・ゲニン、スリカンス・シンガマネニ

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学生物学部

ショーン・ワン

Auragent Bioscience LLC、セントルイス、ミズーリ州、米国

アルテム・メルニコフ & チエン・ジャン

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学、臨床およびトランスレーショナル研究部門、麻酔科

ジェレマイア・J・モリッシー & プラティク・シンハ

サイトマンがんセンター、ワシントン大学医学部、セントルイス、ミズーリ州、米国

ジェレマイア・J・モリッシー & スリカンス・シンガマネニ

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部感染症内科内科

イゲ・ジョージ & スマンス・ガンドラ

ワシントン大学医学部小児科、セントルイス、ミズーリ州、米国

グレゴリー・A・シュトルヒ

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部病理学および免疫学部

ビジャル・A・パリク

NSF Science and Technology Center for Engineering MechanoBiology、ワシントン大学、セントルイス、セントルイス、ミズーリ州、米国

ガイ・M・ジェニン

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SSとRGがこのプロジェクトを発案しました。 RG、SS、IG、SG、GAS、PS、BAP、JJM、GMG が実験を設計しました。 RG はナノラベルを合成し、実験を実施しました。 RG と PG は LFA ストリップを構成しました。 SW と RG は、RMC の数学的計算を実行し、RMC パラメーターの計算に必要なコードを作成しました。 AM はハンドヘルド/ポータブル スキャナを開発しました。 QJ はフルストリップ LFA と必要なナノラベルを構成しました。 RGとJJMはSARS-CoV-2抗体側方流動イムノアッセイを実施した。 RGとZWはSARS-CoV-2抗体イムノアッセイを実施した。 RGとASはSARS-CoV-2抗原イムノアッセイを実施し、鼻腔スワブサンプルを分析した。 RG と SW は、ハンドヘルド スキャナとその後のデータ処理を使用した実験を実行しました。 RG、SS、IG、SG、GAS、BAP、JJM、GMG が結果を分析しました。 RG、SS、GMG が論文を執筆しました。 著者全員がその論文をレビューし、コメントしました。

スリカンス・シンガマネニへの通信。

JJM と SS は、プラズモニック蛍光技術に関する仮特許の発明者であり、この技術はセントルイスのワシントン大学技術管理局から、プラズモニック蛍光製品を開発している Auragent Bioscience LLC にライセンス供与されています。 JJM と SS は、Auragent Bioscience LLC の共同創設者および株主です。 JJM および SS は、ワシントン大学とともに、このライセンス契約を通じて Auragent Bioscience LLC を通じて金銭的利益を得る可能性があります。 AM、QJ、AS は現在、Auragent Bioscience LLC と協力しています。 これらの潜在的な利益相反は明らかにされており、セントルイスのワシントン大学によって管理されています。 他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Biomedical Engineering は、この研究の査読に対する David Walt 氏と Daming Wang 氏の貢献に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

（a）プラズモニック蛍光ベースのNタンパク質LFAから取得され、（b）ベンチトップスキャナーおよび（c）ポータブルスキャナーで測定された、さまざまな濃度のNタンパク質溶液に対応するニトロセルロース膜の用量依存性蛍光画像。

COVID-19 陽性 (PCR 確認済み) の個人の血清中の IL-6 の定量的検出に使用されるフル ストリップ IL-6 p-LFA の概略図。

(a、b) PCR 陽性者の血清サンプル、および (c、d) IL-6 の定量分析用のブランクに曝露された IL-6 p-LFA ストリップからポータブル スキャナーによって取得されたデータに対して行われたデータ処理の代表例集中。

補足的な方法、図、表、参考文献。

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転載と許可

Gupta, R.、Gupta, P.、Wang, S. 他プラズモン活性抗体結合蛍光ナノ粒子による超高感度ラテラルフローアッセイ。 ナット。 バイオメッド。 工学 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41551-022-01001-1

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受信日: 2022 年 1 月 14 日

受理日: 2022 年 12 月 20 日

公開日: 2023 年 2 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-01001-1

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